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双酶复合水解谷朊粉制备小肽的工艺条件研究
李清丽 王卫国
本研究以谷朊粉为原料,采用胰蛋白酶、复合蛋白酶水解谷朊粉蛋白,以水解度[1]、氮溶解指数[2]为评价指标,以反应pH值、加酶量、底物浓度、反应时间、温度为影响水解度大小的主要因素,筛选这两种蛋白酶的单酶和双酶复合的最佳水解条件。
1 材料与方法
1.1 主要原料与试剂
谷朊粉(河南莲花味精集团)、胰蛋白酶、复合蛋白酶(北京诺维信生物有限公司)、L-酪氨酸(第二军医大学正祥化学试剂研究室,生化试剂)、酪蛋白(北京奥博星生物技术有限公司,生化试剂)、福林酚试剂(实验室自制)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(Sigma进口分装)、丙烯酰胺(Sigma 进口分装)。
1.2 主要仪器设备
VIS-723G型可见分光光度计、TDL-5-A型大容量离心机、AR2140型电子分析天平、DYY-Ⅲ-6B型稳压稳流电泳仪、DYY-Ⅲ-28c型电泳槽等。  
1.3 试验方法
1.3.1 水分含量测定
按GB/T6432—94进行。
1.3.2 粗蛋白含量测定
半微量凯氏定氮法(按GB/T6435—86进行)。
1.3.3 蛋白酶活力测定
采用福林-酚试剂法。
1.3.4 水解度测定方法——甲醛滴定法
1.3.4.1 甲醛滴定法测水解液中氨基氮
取水解蛋白液5.00 ml置于小烧杯中,加入20 ml去二氧化碳蒸馏水并磁力搅拌,用精密pH计指示pH值并加入0.1 mol/l NaOH滴至pH=8.2,然后加入已中和好的甲醛溶液10 ml,记录将其pH值滴定至9.2时所耗0.1 mol/l NaOH的毫升数[3];作空白试验。水解蛋白液中蛋白质的氨基氮为:

式中:A——滴定样品消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml);
B——滴定空白消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml);
N——氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/l);
k——1 mol/l氢氧化钠1 ml相当于氮的质量(g),k=0.014;
V——样品的体积(ml),在该试验中V= 5 ml;
V1——水解液的总体积(ml),在该试验中V1=100 ml。
1.3.4.2 水解度计算公式
水解度=
1.3.5 蛋白酶水解谷朊粉试验步骤
单酶水解:取一定量的谷朊粉溶于100 ml的缓冲溶液中,在适宜的温度下加热10 min,冷却至酶的最适温度下保温10 min,加酶,在恒温震荡器上震荡一定时间,然后在沸水中放置10 min灭酶活。灭酶活后移取50 ml水解液于离心管离心(3 000 r/min,10 min),取上清液进行指标的测定。
复合酶水解:取一定量的谷朊粉溶于100 ml的缓冲溶液中,在适宜的温度下加热10 min,冷却至酶的最适温度下保温10 min,加一种酶在恒温震荡器上震荡一定时间,取出冷却至室温,用酸碱调至第二种酶的pH值,在第二种酶的最适温度下保温10 min,加酶在恒温震荡器上震荡一定时间,然后在沸水中放置10 min灭酶活。灭酶活后移取50 ml水解液于离心管离心(3 000 r/min,10 min),取上清液进行指标的测定。
1.3.6 谷朊粉水解物分子量分布
采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳技术测定水解产物分子量。
2 结果与讨论
2.1 原始谷朊粉基本指标的测定
测得谷朊粉样品的粗蛋白为70.01%,水分为7.51%,总氨基酸为66.78%。
2.2 酶活的测定
测得试验所用的蛋白酶酶活分别为:胰蛋白酶9.659×103 U/g、复合蛋白酶8.64×104 U/g。
2.3 胰蛋白酶水解工艺条件确定
在单因素试验的基础上进行正交试验,试验条件T=40 ℃、pH=8.5,正交试验的因素水平见表1。

本试验选择L9(34)正交试验表,试验结果及数据的极差分析如表2。

通过极差分析方法可知,在T=40 ℃、pH=8.5的条件下,三因素对水解度影响的大小顺序是:酶浓度>水解时间>底物浓度,其中酶浓度、水解时间影响显著(P<0.05)。以水解度要求大的角度考虑,最佳试验方案应选A3B1C3,此条件下的水解度为12.38%。
2.4 复合蛋白酶酶解工艺条件研究
试验条件T=50 ℃、pH=6.3,正交试验的因素水平见表3。
本试验选择L9(34)正交试验表,试验结果及数据的极差分析见表4。

通过极差分析方法可知,在T=50 ℃、pH=6.3的条件下,三因素对水解度影响的大小顺序是:酶浓度>底物浓度>水解时间,其中酶浓度、底物浓度影响显著(P<0.05)。以水解度要求大的角度考虑,最佳试验方案应选A2B2C3,此条件下水解度为12.13%。
 2.5 复合酶水解
复合酶试验采取先加胰蛋白酶酶解,再加复合蛋白酶酶解。得到的优化水解条件为胰蛋白酶9%,底物浓度为1.0%,pH值为8.5,温度40 ℃,时间5 h;复合蛋白酶浓度1.5%,底物浓度为1.5%,pH值为6.3,温度为50 ℃,时间7 h,测得水解度为23.26%。
2.6 酶解谷朊粉水解物分子量分布
测定结果表明,胰蛋白酶与复合蛋白酶复合水解谷朊粉,大部分的水解产物的分子量均在1 000以下,达到了水解的目的。
参考文献
1 吴健中.双酶法生产低苦味大豆多肽的研究.Science and Technology of Food Industry,2003(4):23~26
2 Berot S, Popineau Y,Compoint J. P,et al. Ultrafiltration to fractionate wheat polypeptides. Journal of Chromatography B.,2001(753):29~35
3 赵新淮.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学,1994(11):65~67
(编辑:刘敏跃,lm-y@tom.com

李清丽,河南工业大学生物工程学院,450001,河南郑州。
王卫国(通讯作者),单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期:2007-04-26
★ 河南省科技攻关项目的部分研究内容,项目号:0424030026
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