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禽胰多肽受体的提取、纯化和鉴定研究
赵成萍 张 映
摘 要 试验对禽小脑膜胰多肽受体进行提取、纯化和鉴定研究,结果表明:加0.83 g正-辛基-β-D-葡萄糖(n-ctyl-β-D-glucoside)的提取产物,禽胰多肽受体的浓度最高为0.97 mg/ml,分子量为67 000。
关键词 禽胰多肽;受体;提取;纯化;鉴定
中图分类号 S816.79
Inui等人[1]1992年运用正-辛基-β-D-葡萄糖成功抽提了鸡小脑禽胰多肽受体(avian pancreatic polypeptide receptor,APPR),并保持了其活性。发现APP受体是一种糖蛋白,分子量约67 000。为进一步研究禽胰多肽的生理、生化功能,我们对禽小脑膜胰多肽受体进行提取、纯化和鉴定试验。
1 材料与方法
1.1 试剂
PMSF(苯甲基磺酰氟,Sigma)、HEPES(N-2-羟乙基派嗪-N-2-乙磺酸,Sigma)、正-辛基-β-D-葡萄糖甙(n-ctyl-β-D-glucoside,Sigma)、卡介苗(太谷县防疫站)、羊毛脂、石蜡油、电泳试剂、sephandex G-50(Pharmacia)、DEAE纤维素-32(Whatman 进口分装)、硫酸铵、奈氏试剂、磺酰水杨酸、PBS、蛋白质标准(14 400~97 400 kDa,Pharmacia)、酶标兔抗鸡IgG (Sigma)、3,3-二氨基联苯胺(DAB,Sigma)、硝酸纤维素膜(NC,孔径0.45 μm,浙江黄岩化工厂)、明胶(中国医药公司采购供应站)。
1.2 仪器
高速冷冻离心机(Beckman);JJ-2组织捣碎匀浆机(江苏国华仪器厂);PHS-3C酸度计(厦门分析仪器厂);紫外可见分光光度计(UV-9100,北京瑞利分析仪器公司);B-2蠕动泵(上海统一生化仪器厂);玻璃匀浆器;1 cm×50 cm层析柱。
1.3 禽小脑膜胰多肽受体的提取[3]
准确称取鸡小脑50 g,加250 ml冰冷的0.234 mol/l蔗糖,捣碎至匀浆液,2 100 r/min离心10 min,取上清液,4 ℃、18 000 r/min离心1 h,弃上清液,将沉淀悬浮于30 ml 50 mmol/l tris-HCl(1 mmol/l PMSF,pH值7.4),用玻璃匀浆器于冰上匀浆3次,18 000 r/min离心1 h,弃上清液,将沉淀中加入50 mmol/l HEPES(1 mmol/l PMSF,1 mmol/l MgCl2,pH值7.4)至300 ml,4 ℃混匀,均匀分为3份(每份100 ml)。
将三份溶液中分别加入0.83 g、1.66 g和2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside(浓度分别为0.83%、1.66%和2.49%)室温振荡45 min,4 ℃、18 000 r/min离心45 min取上清液,4 ℃保存备用。
1.4 禽胰多肽受体纯度的鉴定
用10%SDS-PAGE鉴定,安装好电泳槽后,按石继红等的方法[2]依次加完分离胶试剂,充分混匀(注意不可剧烈振荡,避免产生泡沫),迅速倒入两块玻璃板之间,静置30~60 min。等胶凝固后,以同样方法制备浓缩胶。浓缩胶倒至梳子1 cm处停止灌胶,迅速插上梳子,静置30 min凝固。浓缩胶凝固后,拔出梳子,小心加入电极缓冲剂直至没过胶面。取100 μl的样品和标准蛋白,分别加入等体积的样品溶解液,混匀后,沸水浴2~5 min,室温冷却后点样,每孔10 μl。电泳时开始电压为40 V,待指示剂进入分离胶后,调电压至60 V,恒压电泳直至指示剂距离底部0.5 cm为止。电泳完毕后,卸槽,将胶置于固定液中过夜,将固定液倒出,加染色液染色1.5 h,用蒸馏水冲洗4~5次后,再用脱色液脱色至蛋白区带清晰。用凝胶成像仪拍照,结果见图1。

1.5 禽胰多肽受体浓度的检测
采用经验公式法[3],将经鉴定为纯品的样品稀释10倍,用紫外分析仪在波长260 nm和280 nm处分别测出吸光度值(A值),然后利用以下公式进行计算得出蛋白质浓度。
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45OD280-0.74OD260)×稀释倍数
2 结果与分析
2.1 禽胰多肽小脑膜受体纯度的鉴定结果
经10%SDS-PAGE鉴定,添加0.83 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物分子量为67 000,与Inui的实验结果一致,且禽胰多肽小脑膜受体纯度高。而添加1.66、2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物则纯度低(见图1)。说明在整个APPR的提取过程中,表面活性剂n-ctyl-β-D-glucoside的浓度是关键。
2.2 禽胰多肽受体浓度的检测结果
经公式法测定和计算,禽胰多肽受体的浓度为0.97 mg/ml。
3 讨论
在禽胰多肽小脑膜受体的提取过程中,要注意温度是低温,否则影响实验结果。禽胰多肽小脑膜受体纯度以添加0.83 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物纯度最高,禽胰多肽受体的浓度为0.97 mg/ml,而添加1.66、2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物则纯度低。说明在整个APPR的提取过程中,表面活性剂n-ctyl-β-D-glucoside的浓度是关键。
参考文献
1 Fuxe K, Agnati L F, et al. Intracisternal administration of avian pancreatic polypeptide lowers respiration rate and enhances the clonidine induced reduction of respiration rate in   alpha-chloralose anesthetized rats: possible interactions with an alpha 2-adrenergic   receptor. Acta Physiol Scand Jul,1982,115(3):381~384
2 石继红,赵永同,等.应用SDS-PAGE显示小分子多肽技术的探讨.生物工程进展,2001,21(1):38~41
3 王金胜,等编著.农业生物化学研究技术.中国农业出版社,2001
4 巩强.禽胰多肽受体的免疫组化研究.山西农业大学硕士论文,2004(编辑:刘敏跃,lm-y@tom.com

赵成萍,山西农业大学生命科学学院,030801,山西太谷。
张映,单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期:2007-09-09
★ 山西省自然科学基金项目(20011090)和山西农业大学科技创新基金(2006009)
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