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猪源Cathelicidins抗菌肽家族的研究进展

马文强 冯 杰 王 燕
摘 要 Cathelicidins是一类在哺乳动物中发现的含有保守的cathelin 区域的抗菌肽,是宿主防御系统的重要组成部分,具有广谱且强大的抗菌活性。文中综述了猪源Cathelicidins抗菌肽家族的基因组成、结构、抗菌活性、作用机制及应用前景。
关键词 猪;Cathelicidins;抗菌肽;结构;作用机理
中图分类号 S816.79
Advances in the research of cathelicidins antimicrobial peptides from pig
Ma Wenqiang, Feng Jie, Wang Yan
Abstract Cathelicidins, a family of mammalian antimicrobial peptides that carry a highly conserved cathelin domain, are important components of host-defense immunity system. They exert a broad spectrum and potent antimicrobial activities. This review is aimed at providing a general overview of cathelicidins from pig, with emphasis on aspects such as biosynthesis genes, structural features, antimicrobial spectrum, and mechanism of action and application outlook.
Key words pig;cathelicidins;antimicrobial peptides;structure;mechanism
抗菌肽是一类带正电荷的两亲性小分子肽的总称,是宿主非特异性防御系统的重要组成部分,不仅对细菌、真菌有广谱的抗菌活性,对病毒、原虫及癌细胞也有作用。由于抗菌肽的抗菌作用机制独特,不易诱导耐药菌株的产生,在当前抗药性蔓延和筛选新的抗生素愈发困难的情况下,抗菌肽可能成为抗生素的新来源。根据抗菌肽的来源、结构等特征,人们将抗菌肽分成两大类:Defensins(防御素)和Cathelicidins。Cathelicidins 是一类在结构上存在很大差异的抗菌肽,由于分子中都含有与cathelin(一种从猪白细胞中分离出来的蛋白质,分子量为12 kDa)非常相似的一段结构,因此将其命名为Cathelicidins。目前在猪身上发现Cathelicidins有PR-39、PG1~5(Protegrin)、PF1~2(Prophenin)和PMAP等四类9种主要抗菌肽。本文就猪源Cathelicidins 抗菌肽家族的研究进展作一综述。
1 猪源Cathelicidins抗菌肽家族的结构
1.1 基因结构
研究证明编码Cathelicidins 基因有4个外显子和3个内含子,如图1所示。前3个外显子编码前体区,第4个外显子编码酶切位点和抗菌区域。前体区含有123~144个氨基酸残基,包括一个29~30个残基的信号肽和一个长约94~114个氨基酸残基的 cathelin 前段。C-末端区域含有长12~97个氨基酸残基的成熟肽段。前体区具有高度的同源性,猪种内同源性达100%。

1.2 氨基酸结构
1.2.1 PR-39的氨基酸结构
猪抗菌肽PR-39由Agerberth等人于1991年最先从猪小肠组织中分离纯化出来。经氨基酸序列分析,PR-39一级结构含有7种氨基酸,富含脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)两种氨基酸残基(其中有19个脯氨酸和10个精氨酸),由39个氨基酸残基构成,故称其为PR-39(Proline-arginine-rich)。其余氨基酸残基分别为苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。PR-39氨基酸排列顺序为:RRRPRPPYLPRPRPPPFFP PRLPPRIPPGFPPRFPPRFP。在其结构中脯氨酸和精氨酸构成的Pro-Arg-Pro结构,可能与细菌磷脂膜的相互作用有关。经圆二色谱和傅立叶变换红外光谱分析,PR-39在水溶液中并不像其它抗菌肽那样形成α-螺旋或β-折叠,而呈伸展性螺旋构象,这可能与其脯氨酸含量有关。
1.2.2 Protegrins的氨基酸结构
猪抗菌肽Protegrins(PG)作为抗菌肽Cathelicidin家族的成员,共分为5种,即PG1~5(见图2),最初从猪白细胞中分离得到。近年来,在仔猪的淋巴组织中也分离得到了其mRNA。Protegrins是一类富含Cys、Arg的小分子肽,分子量约2 kDa,都含有2个分子内二硫键。

成熟的Protegrins 含有16~18个氨基酸,因富含Cys和Arg而携带一定量正电荷,因此是一种阳离子肽。Kenneth等通过X-射线晶体衍射法得到PG-1 的氨基酸结构图。同理推测PG2~5的氨基酸结构见图2。由此我们可以看出PG-1、PG-3和PG-5的氨基酸序列完全相同。
1.2.3 Prophenin的氨基酸结构
Prophenin(PF)是另一个从猪嗜中性粒细胞中分离得到的抗菌肽,含有79个氨基酸残基。近年来,在猪的肺和Cuiosurf中也分离出了PF。经氨基酸序列分析,PF一级结构中富含脯氨酸(53.2%)、苯丙氨酸(19%)和精氨酸(7.6%)。根据结构不同分为两种,即PF-1和PF-2。PF-1的分子量是8 683 Da,是由79个氨基酸残基编码的含有cathelin的前体肽,含有42个脯氨酸(53.2%)和15个苯丙氨酸(19.0%)残基。PF的一级结构最显著的特征为6个十聚体(富含脯氨酸,FPPP NFPGPR)串联重复。PF同PR-39一样在水溶液中呈伸展性螺旋构象。
1.2.4 PMAPs的氨基酸结构
猪髓源性抗菌肽PMAPs是通过cDNA克隆发现的,根据其结构差异分为PMAP-23、PMAP-36和PMAP-37,它们分别含有23、36和37个氨基酸残基。圆二色谱分析表明PMAP-36和PMAP-37具有两亲性α-螺旋,而PMAP-23呈发夹结构。序列比较发现,PMAP-23与已发现的抗菌肽都没有显著的相似之处,而 PMAP-36与兔的cathelicidin CAP18有35%的同源性。虽然PMAP-37与猪cecropin P1有可忽略不计的相似性,但却与两个昆虫抗菌肽cecropins A和B 有50% 以上的同源性。因为它们来源于完全不同的祖先,所以没有进化关系存在。
2 抗菌肽PR-39、PGs、PF和PMAP的抗菌作用及抗菌机理
Cathelicidins中的抗菌肽尽管在抗菌效果显著上各有侧重,但它们都有着广谱高效的抗菌效果,对革兰氏阳性菌和阴性菌(如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等)、真菌(如白色念珠菌、隐球菌等)、原生动物以及病毒有很好的杀菌效果。不同结构的肽抗菌活性有很大的不同。通常富含脯氨酸和精氨酸的肽对革兰氏阴性菌比对革兰氏阳性菌有更好的效果。
2.1 PR-39的抗菌作用和机理
猪抗菌肽PR-39的抗菌作用主要是针对革兰氏阴性菌,对部分革兰氏阳性菌也有抗菌效果。Agerberth等用分离纯化得到的PR-39作抗菌分析,发现PR-39能明显抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和醋酸钙不动杆菌等革兰氏阴性菌,对巨大芽孢杆菌和化脓链球菌也能产生抑菌效果,而对其它一些菌株如普通变形杆菌、铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌即使在200~300 μmol/l下也没有抑制作用。用合成的PR-39作抗菌试验,也有类似的结果。
1993年Boman等人研究发现PR-39发挥抗菌作用时并不形成孔道,不裂解细菌,而是通过抑制细胞内DNA和蛋白质的合成来杀灭细菌。Shi等用扫描电镜观察证明,PR-39与细胞作用时并没有在膜上形成孔道。目前已知PR-39依靠精氨酸残基的正电荷与细菌细胞磷脂膜之间形成静电引力作用后吸附在细胞膜上,然而至于其如何透过脂质双层进入细胞内,从而抑制DNA和蛋白质合成的确切机制尚不清楚。另外,PR-39对中性粒细胞的趋化作用,即调控中性粒细胞在感染部位聚集,促进其对病原体的吞噬,可能也是PR-39抗菌作用的一个方面。
2.2 Protegrins的抗菌作用和机理
研究表明,抗菌肽PG-1具有广谱的抗革兰氏阴性和阳性菌、抗真菌及多种性传播病菌及独特的抗人类的HIV病毒的生物学功能。在浓度为1~5 μg/ml时,PG-1能够在体外杀死许多革兰氏阴性菌,包括大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙眼衣原体和结核杆菌。通过性传播的淋病双球菌、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2和HIV-1都对PG-1比较敏感。Mosca等采用肉汤微量稀释法测定PG-1对几种典型的G+、G-细菌及C. albicaus 真菌的抗菌活性,结果表明,PG-1具有很强的抗细菌活性和中等程度的抗真菌作用。
PG的阳离子肽的性质决定PG可与细胞膜上阴离子发生交互作用。但是,其抗微生物的活性主要还是依赖于其在细胞膜上形成孔道的能力。Sokolov等研究表明:PG-1和PG-3能够改变细胞膜和人工合成的磷脂膜的通透性。PG-1可在不含有LPS的磷脂双层上形成微弱的阴离子选择性通道并引起K+释放;在含有LPS的磷脂双层膜上形成中等强度的阳离子选择性通道,即细菌的细胞膜敏感性更高。Heller等(2000)通过圆二色谱法对PG-1构象分析的结果表明,PG-1在脂质双层中呈S 状态向I 状态转变过程。在S状态时,PG-1与膜相互作用,并以剂量依赖方式降低双层膜的厚度而跨越双层膜,随即转变为I状态。
2.3 Prophenin的抗菌作用和机理
有研究表明,在低阴离子浓度下(10 mmol/l PBS),PF-1可有效地抗革兰氏阴性菌,但对革兰氏阳性菌没有作用。在生理盐水(10 mmol/l PBS和0.1 mol/l NaCl)中PF-1的抗菌活性被抑制。即使在低离子浓度下重复的十聚体和疏水的尾部也没有抗E. coli活性,对于它们潜在的功能还不清楚。并且PF-1 在体外抗E. coli的活性高于Listeria monocytogenes。
研究表明,如果在cathelin和cathelicidins的共同切割位点缬氨酸之后将PRO序列切割掉,PF的前体将被处理成一个97个残基的成熟肽,而实际的成熟产物是PF-1和PF-2,是仅含有C-端79个氨基酸残基的片段。并且在PF-1的共同切割位点和N-端之间人工合成13个氨基酸,称为tritrpticin,显示了强的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。然而,这13个残基肽是否存在于自然界中还需要证明。如果确实存在,意味着有可能cathelicidin 的前体可以被加工成两个具有功能活性成熟的抗菌肽。
研究发现PF-1的片段含有62~79个氨基酸残基,包括了C-端的18个氨基酸残基。这个片段在一定浓度时具有抗B.megaterium Bm11和E. coli D21活性。在猪肺的有机提取物和Curosurf均发现该片段的存在。Harwig及其合作者发现PF由胰岛素裂解产生的从N-端42个氨基酸残基到将近C-端的片段保留3部分抗E. coli活性,而从N-端1~41的片段没有活性。以上的研究表明了PF的C-端片段可能是发挥抗菌作用的重要部位。
2.4 PMAPs的抗菌作用和机理
目前PMAP-23、-36、-37这三种抗菌肽还没有从自然原料中纯化,合成的肽在体外具有显著的抗革兰氏阴性菌和阳性菌的抗菌活性。PMAP-37是最强的膜活性因子,在0.2~1 μmol/l使细菌内膜渗透性破坏,而PMAP-23和PMAP-36杀灭细菌分别在1~10 μmol/l和10~50 μmol/l。但是PMAP-37在10~50 μmol/l时对人的红细胞有溶血作用,对于PMAP-23和PMAP-36即使在100 μmol/l时也没有此作用。
抗菌肽PMAP-23在体外,其合成肽显示了显著的抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母、真菌和霉菌的抗菌活性。在原生质膜上观察到其抗细菌和抗真菌,还可以阻止真菌细胞膜的再生。
3 应用前景
近年来,由于抗生素和传统兽药及饲料添加剂广泛使用所导致的抗药性和药物残留问题已经日益严重地威胁着人们的健康,寻找新型的抗菌药物是解决抗药性问题的一条有效途径。由于抗菌肽具有抗菌能力强、抗菌谱广、种类多、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变的性质,是一类非常理想的候选药物。其将在生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程方面有着广阔的应用前景。

(参考文献21篇,刊略,需者可函索)
(编辑:张学智,mengzai007@163.com

马文强,浙江大学饲料科学研究所,博士,310029,浙江省杭州市秋涛北路164号。
冯杰,单位及通讯地址同第一作者。
王燕,浙江银冠兽药饲料有限公司。
收稿日期:2007-08-20

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