孙 洁 祁克宗 李 娜 刘红梅 高 恒
摘 要 作为动物体内防御系统最大的成员，鸡beta-defensin是鸡体内唯一存在的防御素种类，实验选取本实验室自行饲养的罗曼鸡作为实验材料，从鸡的肝脏提取总RNA运用RT-PCR技术克隆出鸡β-防御素cDNA片段Gallinacin-1、8、9、10，并进行测序，为进一步进行表达做了一项基础工作。
关键词 鸡；β-防御素；序列
中图分类号 Q785
动物体内的防御素（defensins）是动物内在防御系统最大的成员，它是一类富含半胱氨酸的阳离子活性肽。防御素广泛表达于动物的组织细胞中，具有广谱的抗菌、抗病毒活性和非特异的细胞毒性作用，同时，动物防御素还可以调节体内适应性免疫及其它抗微生物免疫活性。一旦可以通过基因工程将其大量表达，就有可能替代传统抗生素及一些化学性的防腐剂，对食品安全及临床治疗将会具有重要的意义。
防御素家族主要被分为α、β两个亚类，家禽体内只含有β-防御素。因此该实验选取本实验室自行饲养的罗曼鸡作为实验材料，从鸡的肝脏提取总RNA，运用RT-PCR技术克隆出鸡β-防御素cDNA片段Gallinacin-1、8、9、10，并进行测序，为进一步进行表达做了一项基础工作[1-5]。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
罗曼鸡肝脏取自本实验室饲养的15日龄罗曼鸡；总RNA提取试剂盒采用TRIzol LS RNA提取试剂盒，购自上海生物工程公司；M-MLV以及PGEM-T easy 载体购自promega公司。
1.2 实验方法
1.2.1 PCR引物的设计与合成
根据genbank中发表的基因序列结合Primer5.0进行分析，决定采用表1中的引物序列。
1.2.2 鸡肝总RNA的提取
按照TRIzol使用说明书进行：剪取少量肝脏组织，分别加入1 ml TRIzol试剂，用匀浆器进行研磨，研磨充分，室温静置5 min；12 000×g离心5 min，弃去沉淀；加200 μl氯仿，振荡混匀后，室温放置15 min；4 ℃、12 000×g离心15 min，吸取上层水相，加入500 μl异丙醇，室温放置5~10 min；4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清液，RNA沉于管底；加75%的乙醇（DEPC水配制）1 ml，温和振荡；4 ℃、800×g离心5 min，弃上清液，室温晾干。
1.2.3 RT-PCR反应和cDNA扩增
cDNA第一链的合成参照M-MLV反转录酶说明书进行。
反应体系（20 μl）：RNA 3 μl；5×buffer 4 μl；dNTPs 6 μl；RNA酶抑制剂0.5 μl；Primer2 1 μl；M-MLV 2 μl；DEPC水补至20 μl。
混匀后室温放置10 min，42 ℃水浴1 h，RT产物直接用于PCR扩增。
PCR总反应体系为(50 μl)：10×buffer 5 μl；25 mol/l MgCl2 4 μl；10 nmol dNTPs 2 μl；Primer1 1 μl；Primer2 1 μl；cDNA 5 μl；ExTaq 0.5 μl(约3 U)；加双蒸水至50 μl。
在PCR仪上按照如下过程反应：94 ℃预变性3 min，1个循环；94 ℃、40 s，55 ℃、40 s,72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，1个循环。产物用2%凝胶电泳进行检测[6]，然后进行PCR产物测序。
2 实验结果
2.1 RNA提取结果（见图1）
图1 RNA提取结果
2.2 RT-PCR结果
从罗曼鸡的肝脏中提取的总RNA，经RT-PCR进行反转录合成cDNA第一链，利用引物进行PCR扩增，在2%的琼脂糖凝胶上电泳，各有一条大约200 bp的条带出现，与预计的产物分子量大小吻合（见图2）。
3 分析讨论
鸡β-防御素含有6个稳定的半胱氨酸，分别以1-6、2-4、3-5连接形成3个分子的二硫键，构成稳定的反相平行的3股β-片层结构C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C。二硫键可以使小分子防御素紧密联结以防御蛋白酶水解，所以在富含蛋白酶的吞嗜溶酶体环境中仍能保持其特性，这也是防御素区别于其它抗微生物肽的主要因素。据报道,鸡体内的基因共编码了13种β-防御素，除此之外，目前仍没有新的报导，这些鸡防御素基因被命名为Gallinacin-1～Gallinacin-13，它们密集地分布在染色体的3q3.5～ｑ3.7，长度为86 kb。其氨基酸残基的数目约有63～104个[7]， 以上所得基因片段均包含完整的开放阅读框，为以后进行表达奠定了一定的基础。
随着人们对食品安全的关注，传统抗生素对动物机体有不同程度的毒害作用，且致病菌对目前几乎所有的抗生素产生耐药性，人们正在努力寻找抗生素的替代品,防御素作为一种新型的生物活性肽,可以替代抗生素而发挥更广谱的抗菌作用，同时也可以作为免疫调节剂在调节机体免疫系统感染中发挥重要作用。
在基因工程上应用的防御素具有广谱的抗微生物的活性，因此具有很大的应用潜力。一方面可以研究出高效的细菌或酵母表达系统，以大量生产防御素，应用到食品、医药领域；另一方面从动物的组织中分离出防御素基因，然后导入动、植物体内高效表达，增强动、植物抗菌能力，通过在植物抗病基因工程上的应用，减少化学抗菌剂在农业上的应用，人工合成抗菌肽比自然界提取的抗菌肽具有更高的活性已经成为现实。Jaynes等利用基因改造，获得了比天然提取有更高活性的新型抗菌肽；而人工合成得到的融合抗菌肽有可能表现出比任何一个供体抗菌肽都高的抗菌活性。因此，人工合成抗菌肽并使之广泛应用于临床是完全有可能实现的。美国马盖宁制药公司现已开发出MagaininⅡ、MagaininⅢ两种人工合成抗菌肽,并进入临床Ⅲ期研究,用于治疗肿瘤[8]。
鸡β-防御素是一种重要的免疫因子，具有广谱抗病作用。对鸡β-防御素的开发利用将主要集中在两个方面：一是作为家禽抗病力的指标之一，在培育家禽抗病品种（品系）方面起辅助作用；二是作为抗菌肽的开发利用，但鸡防御素对鸡或其它动物的作用效果还需进一步验证,同时也必须认识到从抗菌肽的开发到最终的临床应用尚需很长的时间,诸如来源问题、如何保持活性问题,以及应用于人体后是否有潜在的致畸性、致癌性等问题,都有待进一步研究。
参考文献
1 Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat Rev Immunol. 2003(3):710~720
2 Lehrer R I, Ganz T. Defensins of vertebrate animals. Curr Opin Immunol. 2002(14):96~102
3 Schutte B C, McCray P B., Beta-defensins in lung host defense. Annu Rev Physiol., 2002,64:709~748
4 Thomma B P, Cammue B P, Thevissen K. Plant defensins. Planta, 2002,216:193~202
5 Froy O, Gurevitz M. Arthropod and mollusk defensins--evolution by exon-shuffling. Trends Genet.,2003(19):684~687
6 萨姆布鲁克等，金冬雁，黎孟枫等(译).H 分子克隆实验指南(第二版).北京：科学出版社，1996.765~780，888~89
7 Yan jing xiao, Austinl, Hughes, et al. A genome-wide screen identifies a single beta-defensin gene cluster in the chicken:implications for the origin and evlutiom of mammalian defensins[J].BMC Genomics,2004(5):56
8 陆莹瑾， 王禾,屈贤铭．抗菌肽的固相合成、分离纯化与构效关系的研究[J]．生物工程学报，1997,13(1):35
（编辑：崔成德，cuicengde@tom.com）
孙洁，安徽农业大学动物科技学院，230036，安徽合肥。
祁克宗（通讯作者）、李娜、刘红梅、高恒， 单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-12-04
★ 基金项目：安徽省自然科学基金（03041204）、安徽省优秀青年基金资助。
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